福建11选5开奖结果查询

蛋白质凝胶污渍 - 许多选择,许多解决方案

如果有一件事你可以指望在今天的分子生物学实验室找到它,它是一个蛋白质凝胶电泳设备。研究人员使用蛋白质凝胶按尺寸和/或在2D凝胶电荷的情况下解析蛋白质,无论是准备进行蛋白质印迹  还是质谱,或仅仅通过眼睛筛选蛋白质表达。

但与DNA凝胶一样,仅仅分离凝胶中的蛋白质是不够的; 他们也必须染色。事实证明,有几种方法可以使蛋白质可见。使用哪种方法是灵敏度要求,可用硬件和下游应用的函数。

基本染色方法

研究人员可以使用三种主要类别的染色剂来治疗他们的日常蛋白质凝胶:考马斯,银和荧光。根据Sigma-Aldrich蛋白质技术和分析的**研发经理Jeffrey Turner的说法,在这些选项之间进行选择主要归结为“灵敏度与速度”。

特纳西说,考马斯可能是**常用的染色剂,作为一种视觉,比色(亮蓝)染料,它不需要特殊设备。Bio-Rad Laboratories的业务发展经理Ning Liu表示,它的灵敏度**低,检出限约为10-100 ng蛋白质。

公司通常提供多种染料配方,其易用性,总染色时间和缓冲剂和脱色要求各不相同。例如,一些需要固定在酒精/酸洗液中,而另一些则需要使用纯净水。将Expedeon的InstantBlue TM  试剂(也可从Sigma-Aldrich获得)在电泳后直接添加到凝胶中,不需要固定或脱色,并且在约15分钟内完成染色。另一方面,Bio-Rad Laboratories的QC Colloidal Coomassie Stain方案建议采用更长的程序来满足工业质量控制标准,包括在染色之前在40%乙醇/ 10%乙酸中进行15分钟的凝胶固定步骤。一小时20小时,然后在水中脱水一**三小时。

研究人员可以使用赛默飞世尔科技公司  **新发布的Pierce™Power Stainer 自动进行考马斯染色。根据全球产品经理Emily Goplen的说法,该设备可以一步染色并脱色两种凝胶。“虽然传统染色需要花费数小时才能过夜,但Power Stainer可在约10分钟内完成染色和脱色过程,并可与预制[或]自制SDS-PAGE凝胶配合使用,”她说。

福建11选5开奖结果查询 另一个极端是银染,一种视觉方法,灵敏度为每条带约100 pg**250 pg(0.1 ng**0.25 ng)。刘说,该协议没有脱色步骤,但是“它是一个漫长的过程” - 两个小时左右 - 并且相当挑剔。“此外,特纳补充说,该协议涉及几种有毒化学品,如甲醛和银,通常在通风橱中进行。因此,刘说,“除非敏感性**关重要,否则人们通常会远离这一程序”。

在中间,灵敏度方面,荧光染料,可以检测单位数纳克范围内的蛋白质,只要您可以访问兼容的凝胶文件  系统或透射仪。

与考马斯和银染一样,荧光染色在电泳后使用,并且通常需要固定和脱色。但情况并非总是如此。例如,刘说,尽管SYPRO Ruby需要脱色步骤,但Oriole和Flamingo凝胶染色剂不会,因为游离染料不会发荧光。“[染料]本身不能被激光激发,”他解释说,“只有当它被蛋白质结合时。这就是你不需要洗掉它的原因。“

补充这些选项,也存在特殊试剂。例如,Thermo Fisher Scientific  专门针对糖基化和磷酸化蛋白提供Pro-Q®荧光染色,以及用于标记融合蛋白的纳克级可视化的InVision™ His标签凝胶染色和Lumio™绿色检测试剂盒。

预电泳染色

一些公司提供染色解决方案,消除电泳后的洗涤和染色。例如,Bio-Rad的Stain-Free™预制凝胶预先加载了色氨酸结合的“三卤”荧光染料。电泳后,将凝胶暴露于紫外光下会激活染料,使其与蛋白质共价结合。据刘说,灵敏度“与考马斯相当”。

另一种选择是 GE Healthcare Life Sciences业务的Amersham™WB系统。使用该系统,样品在电泳之前以10或30分钟的反应共价偶联**Cy TM 5荧光团。去污剂不是必需的 - 染料从染料前端流出凝胶 - 灵敏度在50到100-pg范围内,**小动态范围为三个数量级,GE的**科学家ÅsaHagnerMcWhirter说道医疗生命科学。McWhirter说:“你甚**不需要拆开凝胶盒”来看凝胶图案。系统在电泳结束时直接自动对凝胶成像并分析结果。

Liu和McWhirter都指出,电泳前染色方法的一个显着优点是染料与分离的蛋白质共价连接。因此,可以在随后的步骤中使它们可视化,特别是在蛋白质印迹中,并且使用总蛋白质信号而不是选择的“管家” - 蛋白质水平来标准化西方靶标信号。(通过使用诸如考马斯蓝,Ponceau S和Thermo Fisher Scientific的Pierce™可逆蛋白质染料等试剂,也可以对西方膜进行染色以获得总蛋白信号。)

“这种方法显然消除了人们对家政 - 蛋白质负荷控制的两大担忧,”刘说。首先,管家蛋白质水平有时会在实验条件下发生变化。它们也可能存在于印迹线性动态范围之外的水平,使量化变得复杂。实际上,他指出,生物化学杂志**近更新了其作者指南,以反映这一事实。“将信号强度标准化为总蛋白质负荷(通过使用考马斯蓝,丽春红S或其他蛋白质染色剂染色膜评估)是优选的,”指南现在说明。“没有证据证明实验操作不影响其表达,'不应该使用'保持'的蛋白质进行标准化。”

McWhirter表示,预标记还可显着提高凝胶与凝胶的重现性,因为洗涤和染色步骤难以精确控制。“你在管中进行的反应之间的CV [方差系数]远低于使用托盘​​在不同溶液中孵育凝胶,”她指出。实际上,她声称在对14个相同样本的一次内部分析中,蛋白质Cy5信号的CV平均约为5%。“这基本上和移液错误一样好。”

**后的考虑

无论您选择哪种污渍,除敏感度,速度和硬件要求外,还有一个关键考虑因素是您打算使用凝胶下游。例如,研究人员通常不会在印迹之前用考马斯蓝染色凝胶,因为该染料通常需要固定步骤,可以将蛋白质捕获在凝胶中; 相反,它们要么平行运行第二个相同的凝胶并染色,要么在转移后染色印迹。类似地,共价附着于蛋白质的染料可能潜在地干扰抗体结合或质谱分析。

福建11选5开奖结果查询 Goplen说,**终,没有一个通用的解决方案。所有人都同意,考马斯是大多数研究人员的**染色剂。但是当出现特殊情况时,知道还有很多其他选择可能不是很好吗?

联系我们
客服电话
  • 17051050460
  • 0571-58120942
福建11选5分布走势图 福建11选5 福建11选5开奖结果查询 福建11选5 福建11选5 福建11选5走势图 福建11选5开奖结果 福建11选5走势图 福建11选5 福建11选5走势图