改善蛋白质印迹重复性

重复性对于科学过程**关重要,使其他实验室能够验证并在已发布的结果基础上进行构建。但越来越明显的是,科学文献并不总能满足这些期望。这种不确定性大部分源于方法细节的报告不一致,导致对结果的错误解释。这些方法本身也可能导致不可再现性。

2013年,Nature推出了  新的编辑标准,以提高生命科学文献报道的一致性和质量。这些标准要求作者“描述可能引入偏倚或影响稳健性的方法学参数[1],”包括“反映测定和/或样品制备[2]变异的技术重复”。

蛋白质印迹是一种具有固有变异性的方法。不同的抗体批次和克隆可能表现不同,因此很难比较实验室之间甚**同一实验室内的结果。凝胶加载,转移效率和其他因素是额外的,公认的可变性来源。

Western blotting的另一个关键方面受到较少关注:检测和成像。这一方面对于定量比较**关重要,蛋白质水平的相对分析越来越常见。使用比色,化学发光或荧光方法用标记的抗体检测蛋白质印迹。化学发光检测是**常用的方法,也是**难以准确量化的方法。

LI-COR Biosciences的科学家**近研究了化学发光蛋白质印迹成像中的变异性和误差来源。在这里,我们回顾他们的发现。

化学发光的局限性

化学发光蛋白质印迹使用酶缀合的抗体来催化反应。底物分子的氧化产生瞬态光信号。当反应发生时,发射的光用X射线胶片或数字成像器成像。

化学发光蛋白质印迹成像的可变性和误差来自两个关键来源:酶化学发光反应的动力学,以及发现捕获微弱和强信号的“**佳”暴露的挑战。

化学发光检测的酶促性质使得灵敏度高但依赖于底物浓度。这是一个问题,因为底物浓度随着反应的继续而变化 - 并且在印迹的不同区域以不同的速率变化。在具有高抗体浓度(强条带)的区域比低浓度(较暗条带)更快地消耗底物。

随着反应的进行,基板可用性的变化会影响强和微弱带的相对信号强度。如果较少的基板可用于氧化,则较强的信号变得不足。这种不可预测的,无声的可变性来源取决于图像捕获的时间和印迹上的试剂分布。由此产生的可变性可能限制从一个实验到下一个实验的再现性。

此外,大多数印迹成像方法需要多次曝光以记录该方法的线性范围内的微弱和强带。但是,在甚**检测到较弱的信号之前,强烈的信号可能会使许多检测方法的容量饱和或“爆炸”。短时间曝光通常用于捕获线性范围内的强条带,然后进行更长时间的曝光以检测较暗的条带。在单次曝光中准确捕获所有信号强度几乎是不可能的,并且反应的动态性质使得识别“**佳”曝光时间变得更加困难。

在线性范围内成像

检测方法的线性范围决定了多次暴露的必要性,以及酶/底物动力学对结果的潜在影响。理想的成像方法可以捕获单次曝光中的所有数据,在线性检测范围内捕获微弱和强烈的条带。

我们比较了X射线胶片,商用CCD成像系统(“Imager B”)和LI-COROdyssey®FcImager的线性检测范围。一个Harta发光计参考板,有七个LED,产生超过七个数量级的一致光,用作光源。(见图1)

图1. 各种方法的线性检测范围

薄膜呈现出非常窄的线性范围,不适合广泛的信号强度。成像器B显示出改进的线性范围,尽管在较长曝光期间强信号仍然饱和。LI-COR Odyssey Fc成像仪是三者中**好的,具有非常宽的线性范围并且没有观察到信号饱和。该系统在所有曝光时间内捕获单个图像中的微弱和强信号。

与其他基于CCD的成像器不同,Odyssey Fc系统独特的光学技术可以带来微弱的条带,而不会使较强的条带饱和,并且可以在非常宽的动态范围内(**多6个日志)进行饱和。无需优化图像捕获设置,单个数字图像可替换多个曝光的叠加。

在一次曝光中捕获所有信号减少了化学发光检测动力学引入的可变性。在酶促反应的同一阶段收集微弱和强烈的条带,以获得更一致的底物可用性和更可靠的定量分析-特别是当条带强度变化时。该系统还检测两个波长的近红外荧光信号并对DNA凝胶成像。

提高蛋白质印迹的重现性

当然,可以从胶片或标准数字成像器获得可靠的结果。您需要仔细校准每个实验的线性范围。使用内部对照进行标准化可以提高精确度,但要确保在系统的线性范围内检测到对照和目标蛋白质。提高精度可能需要稀释系列,额外的控制和大量的技术重复。

新的自然报告要求强调了在线性范围内检测的重要性,并且不鼓励使用仅显示强烈波段的短曝光。对于电泳和凝胶数据,指南指出,“必须使用具有线性信号范围的适当试剂,对照和成像方法。曝光通常应该是产生灰色背景。不鼓励使用高对比度的凝胶和印迹,因为过度曝光可能掩盖其他条带。如果高对比度是不可避免的,应在补充信息中提供多次曝光[2]。

该研究表明,LI-COR Odyssey Fc成像仪可以为化学发光蛋白质印迹提供更准确,定量的解决方案。消除多次曝光的需要简化了数据分析,并**大限度地减少了化学发光检测过程中酶/底物动力学引入的变异性。在单个图像中捕获全部数据有助于您获得始终如一的可靠结果-并且更容易满足发布Western印迹数据的新的,越来越严格的要求。

完整的研究“Western Blots的胶片和CCD成像:曝光时间,信号饱和度和线性动态范围”(LI-COR Biosciences,2014)可在此处获得。

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