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提交凝胶切片进行蛋白质测定时,请注意角蛋白和其他杂质

质谱(MS)是一种基于质量差异表征和定量蛋白质的方法。当蛋白质在实验室中无法解决时,研究人员通常会将从凝胶中切下的条带提交给专门的MS设施进行蛋白质测定。然而,这项服务的价格为每5毫米凝胶切片180美元。重要的是要注意设施可能提交的任何指导方针或限制。为了获得**大收益,我们收集了以下建议。 

避免角蛋白污染

当使用1D或2D凝胶/ MS和液相色谱(LC)/ MS平台时,角蛋白污染是常见问题。角蛋白是一种天然存在的蛋白质,常见于指纹,头发,死皮,羊毛衣物,DTT,β-巯基乙醇,缓冲剂和乳胶手套。在低浓度下,角蛋白不是问题。但是当角蛋白的浓度大于目标蛋白质时,角蛋白会压倒MS系统。为尽量减少污染,请始终穿上实验室外套并使用非乳胶手套。任何接触凝胶或样品的物质都可能是污染源。在浇铸之前用70%乙醇彻底清洗所有板。避免将凝胶存放在保鲜膜中,并使用新的,干净的塑料或玻璃凝胶托盘。将凝胶置于干净的容器中,用70%乙醇或甲醇/乙腈彻底冲洗。在层流罩或其他清洁工作区域内进行整个凝胶内消化。没有什么比提交样本只是为了获得无价值的数据 - 或者没有数据 - 的回报更糟糕的了。

寻找胰蛋白酶

尽管每种样品在各种MS平台的制备,电离和检测方面都有独特的要求,但是存在一些适用于试剂的一般限制。胰蛋白酶消化产生不同分子量的肽用于MS分析,但胰蛋白酶的特异性值得注意。天然胰蛋白酶经历自溶,产生假胰蛋白酶,其表现出更宽的特异性。在胰蛋白酶制剂中存在的自溶产物导致额外的肽片段,其可能阻碍正确的蛋白质鉴定。

注意染色限制

染色要求非常具体。确保蛋白质在染色过程中不会共价修饰或不可逆地固定在凝胶中。当通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质复合物的各个组分并通过银(或考马斯)染色显现时,重要的是使用不含戊二醛的银染方案。戊二醛化学修饰蛋白质并抑制后续步骤。对于低丰度蛋白质(通常需要通过银染可见的那些),为了确保您的蛋白质存在于适当的检测限度,通过在多个泳道(10μl**10μl)中运行样品,将多个凝胶条带组合起来是值得的。总共30μl)。对于SDS-凝胶样品,如果可见带有考马斯蓝染色的条带(检测限,100 ng),则可能存在足够的材料用于蛋白质鉴定。污渍的检测限也取决于诸如凝胶厚度和泳道宽度的变量。

仔细切除凝胶带

在剪切任何乐队之前拍摄图像是个好主意。提交一份带有样本的副本,并指出切割带的位置。切割感兴趣的条带时,每个样品都应使用无菌剃刀刀片或手术刀。丙烯酰胺在MS分析中含有许多干扰剂,因此使其存在**小化。省略漫射染色边缘并仅切除明显染色的条带。捕获太少的凝胶意味着样品的损失和太多的凝胶可能降低肽的产率。发现有一个很好的平衡!(MS设施总是试图引入产生有用光谱所需的**少量的材料。太多的样品意味着更高的背景信号,需要停机时间进行清洁。)另外,不要将凝胶切碎,因为小块很容易丢失。仅提交完整的乐队。将每个凝胶带放入单独的干净微量离心管中。不要使用任何带O形圈或垫圈的管子。不要用封口膜或胶带密封,因为它们也是角蛋白污染的常见来源。始终提交空白凝胶切片用作对照。将没有任何液体的碎片存放在-20°C或-80°C的微量离心管中,直到您准备好提交您的皮带。

提交凝胶切片后,MS设施提供的信息越多越好。请记住,纯化的样品总是**有可能进行阳性鉴定。分析纯净的低分子量有机化合物很容易; 混合物更难; 对高分子量化合物的复杂混合物进行综合分析可能非常耗时。但如果您有截止日期,那么大规模设施将与您合作。毕竟,你是顾客!祝你好运。

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